在現代分子生物學研究中，核酸定量是一個不可或缺的步驟。準確的核酸定量對於確保實驗結果的可靠性和可重複性至關重要。無論是進行PCR、基因測序，還是其他分子生物學實驗，瞭解樣品中核酸的精確濃度都是成功的關鍵。
核酸定量的主要重要性體現在優化實驗條件、評估樣品質量、確保下游應用的成功以及節省時間和資源。許多實驗需要特定濃度的核酸輸入，準確的定量可以幫助研究人員優化實驗條件。通過定量，我們可以評估DNA提取和純化的效率，並檢測潛在的污染。在NGS（下一代測序）等應用中，準確的核酸定量對於資料庫製備至關重要。此外，準確的定量可以避免因核酸濃度不當而導致的實驗失敗，從而節省寶貴的時間和資源。
鑑於核酸定量的重要性，選擇適當的定量方法變得尤為關鍵。不同的方法各有優缺點，適用於不同的實驗場景。
在進行核酸定量時，研究人員可以選擇多種方法。每種方法都基於不同的原理，適用於不同的實驗需求。主要的核酸定量方法包括 UV-Vis光譜法（分光光度計法）、 螢光法、 即時定量PCR （qPCR）、凝膠電泳法和毛細管電泳法。這些方法各有特點，從簡單快速的UV-Vis法到高度精確的qPCR法，為研究人員提供了多樣化的選擇。
UV-Vis光譜法是最常用的核酸定量方法之一，以其簡便快速而聞名。這種方法基於核酸在260nm波長處有最大吸收的特性。通過測量樣品在此波長的吸光度，可以計算出核酸的濃度。操作步驟包括用緩衝液校準儀器、測量樣品吸光度，並使用公式計算核酸濃度。
UV-Vis法的優勢在於快速簡便，無需特殊試劑，且可同時評估樣品純度。然而，它也有局限性，如無法區分DNA和RNA，對低濃度樣品不夠敏感，且易受污染物影響。在常規的質粒DNA萃取或基因組DNA提取後的濃度檢測中，UV-Vis法是首選方法。最新趨勢是微量分光光度計的發展，使得只需1-2 μL的樣品即可進行測量，大大提高了工作效率。
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螢光法是一種靈敏度高、特異性強的核酸定量方法，特別適合低濃度樣品的測定。它使用能特異性結合核酸的螢光染料，通過測量螢光強度可以準確定量核酸。操作步驟包括製備標準曲線、混合樣品與螢光染料、測量螢光強度，並根據標準曲線計算核酸濃度。
螢光法的優勢包括高靈敏度、高特異性，以及受污染物影響小。然而，它需要特殊的螢光染料和儀器，成本相對較高，且需要製作標準曲線。在NGS資料庫定量或cfDNA等低濃度樣品的定量中，螢光法是首選方法。最新趨勢是新型螢光染料的開發，提高了檢測的靈敏度和特異性。
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qPCR 是一種結合PCR擴增和螢光檢測的高度靈敏和特異的核酸定量方法。它通過實時監測PCR過程中產生的螢光信號強度來定量初始樣品核酸的量。操作步驟包括設計特異性引子和探針、製備反應試劑、運行qPCR程式，以及分析擴增曲線和Ct值。
qPCR的優勢在於極高的靈敏度、高度的序列特異性，以及可同時進行定量和定性分析。然而，它需要專門的設備和試劑，成本較高，操作相對複雜，且耗時較長。在檢測基因表達水準、病毒載量定量或極低濃度核酸樣品的定量中，qPCR是首選方法。對於FFPE樣本中降解的DNA，qPCR是最可靠的定量方法。
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凝膠電泳法是一種可視化的核酸定量方法，特別適用於評估核酸的完整性和大小。它基於核酸在電場中的遷移速度與其分子量成反比的原理，通過比較樣品與已知濃度的核酸標準品的亮度來進行半定量分析。
凝膠電泳法的優勢在於可同時評估核酸的濃度、大小和完整性，直觀可視化，且不需要昂貴的專用設備。然而，它僅能進行半定量分析，靈敏度較低，且使用有毒染料可能有安全隱患。在檢查PCR產物、評估核酸完整性或粗略估計核酸濃度時，凝膠電泳法非常有用。
毛細管電泳法是一種自動化程度高、可同時分析核酸濃度和大小的方法。它結合了電泳分離和螢光檢測技術，通過毛細管中的高解析度分離來分析核酸。操作步驟包括樣品製備和加載、自動進行毛細管電泳分離、螢光檢測，以及數據分析和報告生成。
毛細管電泳法的優勢在於高通量、自動化程度高，可同時提供核酸濃度和片段大小資訊。然而，設備昂貴，樣品製備可能較複雜，對操作人員的技術要求較高。在NGS資料庫質量控制、核酸片段分析或大規模樣本篩查中，毛細管電泳法顯示出獨特優勢。
選擇合適的核酸定量方法對於實驗成功至關重要。主要考慮因素包括樣品濃度範圍、純度、特異性要求、時間和成本考慮、下游應用以及樣品類型。高濃度樣品（>10 ng/μL）通常可以使用UV-Vis法，而低濃度樣品（<10 ng/μL）則考慮螢光法或qPCR。對於需要區分DNA/RNA或檢測特定序列的情況，螢光法或qPCR更為合適。NGS資料庫定量通常選用螢光法或qPCR，而FFPE樣本則以qPCR最為可靠。
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方法 |
靈敏度範圍 |
主要優勢 |
主要局限性 |
適用場景 |
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2-5 ng/μL |
快速、簡單、無需特殊試劑 |
無法區分DNA/RNA，易受污染物影響 |
中高濃度純樣品，快速檢測 |
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0.1-0.5 ng/μL |
高靈敏度，可區分DNA/RNA |
需要標準曲線，試劑成本較高 |
低濃度樣品，需高精確度 |
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<0.1 ng/μL |
極高靈敏度，序列特異性 |
設備和試劑昂貴，耗時較長 |
低濃度，特定序列檢測 |
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凝膠電泳法 |
1-5 ng/band |
可視化DNA大小和完整性 |
半定量，靈敏度低 |
核酸完整性檢查，PCR產物驗證 |
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毛細管電泳法 |
0.1-0.5 ng/μL |
高通量，自動化 |
設備昂貴，樣品製備複雜 |
大規模樣本分析，NGS資料庫定量 |
值得注意的是，在日常實驗室工作中，UV-Vis法和螢光法因其便捷性和廣泛適用性，成為最常用的兩種方法。UV-Vis法適用於快速檢測中高濃度的純DNA樣品，而螢光法則在處理低濃度或需要高精確度的樣品時表現出色。
通常螢光法和qPCR的結果更可靠，特別是對於低濃度樣品。UV-Vis法可能因污染物而高估濃度。建議使用多種方法交叉驗證重要樣品的濃度。
使用螢光法或qPCR，這些方法對低濃度DNA更敏感。增加重複測量次數，考慮使用carrier DNA減少樣品損失。確保使用低吸附的離心管和吸頭。
qPCR或特定的螢光法（如Qubit）最適合NGS資料庫定量。qPCR可以特異性檢測帶接頭的資料庫分子，而螢光法提供準確的總DNA濃度。
對於FFPE樣本，qPCR是最可靠的方法。它可以特異性檢測完整的核酸片段，避免了降解核酸對測量的干擾。
核酸定量是分子生物學研究中的關鍵步驟。每種核酸定量方法都有其獨特的優勢和適用場景。選擇合適的方法需要綜合考慮多個因素。在日常實驗室工作中，UV-Vis光譜法和螢光法仍然是最常用的方法。未來，核酸定量技術將繼續發展，包括微流控技術、納米技術、人工智慧輔助等創新方向。研究人員應根據具體需求選擇最適合的方法，同時關注新技術的發展，以不斷提高實驗的準確性和效率。