多重降落PCR (MT-PCR): PCR新應用成就更好的精確性和穩定性
何謂MT-PCR？
聚合酶鏈反應，或稱之為PCR，在各種生化和醫學實驗室均已應用近30年。然而，PCR最突出的問題是因非靶DNA的擴增所導致各種問題，尤其是假陽性結果最為嚴重。幸好多年來PCR技術不斷進步，發展出一種新型PCR技術——多重降落PCR（MT-PCR）。MT-PCR結合了多重PCR和降落PCR的特徵。在一項PCR實驗中，採用了多種引物檢驗多重DNA靶標。每個週期的退火溫度從原設定溫度降低0.5~1°C，直到達到最佳退火溫度。
MT-PCR，出現在2016年*的一項新研究中（1），發展該技術旨在檢測抗性基因。MT-PCR成功地識別出數個不同的靶細菌DNA，還阻止非靶DNA擴增反應，從而阻止假陽性結果。
MT-PCR如何解決多重PCR面臨的問題？
常規PCR試驗的目標是單個DNA範本，特定的引物會在20個反應週期內將範本擴增。在一個反應中採用多個引物和靶DNA，可節省大量時間，還能同時在一個PCR中擴增多個靶DNA*（2）。
但是，多重PCR有一個嚴重的缺點，很難在引物和DNA混合物中避免非靶DNA交叉擴增。因此，進行多重PCR前，我們必須提前選擇特定的靶DNA。只選擇不同DNA配對長度的靶DNA進行多重PCR。
雖然，多重PCR節省時間，但仍無法避免非靶DNA交叉擴增導致的錯誤。因此，我們需要MT-PCR。MT-PCR和多重PCR的主要差別在於退火溫度。MT-PCR的退火溫度隨每個週期降低。設定的第一個週期（起始）退火溫度比預期溫度高 3~5°C 。一般而言，退火溫度越高，引物和範本匹配越好。緩慢降低退火溫度讓PCR更有效。
精確而穩定地控制溫度至關重要
本項MT-PCR研究的研究者在血液培養瓶和加標血液瓶中成功地識別了5個靶DNA，mecA, Blashv, Blactx-M, BlaTem和Blaoxa，參見圖1。同時，沒有交叉擴增和假陽性結果。（圖2），試驗中，在熱迴圈儀上設定的起始退火溫度為66℃，30秒。研究者將反應繼續進行，但是每個週期退火溫度降低0.5℃。溫度控制的精確性和穩定性非常重要。BlueRay Biotech生產的TurboCycler 2 聚合酶連鎖反應儀非常穩定，可精確而穩定地控制溫度。該儀器的升降溫速度快，可迅速設定需要的特定溫度。還有一個樣品模式，將樣品和受試塊的溫差控制在最小絕對值。TurboCycler 2是研究者進行MT-PCR的理想選擇。
圖1
圖1.來自12個加標血液培養瓶的樣品的MT-PCR結果。第9~第13是靶基因的對照組。第1~第8明確顯示靶基因在MT-PCR陣列中表達，且無其他交叉擴增。
圖2
圖2.來自33個陽性血液培養瓶的樣品在4h MT-PCR陣列的結果。明確顯示靶基因，且無非靶基因表達。
在本項研究中，靶細菌DNA含有多重抗生素耐藥性基因。被這些細菌感染的患者要及時接受正確的抗生素治療，否則敗血症會導致嚴重的後果。該項研究工作證明，MT-PCR可迅速鑒別有關細菌。
結論
MT-PCR不但可以迅速識別樣品中多個靶細菌的基因，而且，還可以避免非靶DNA交叉擴增。與以往相比較，假陽性結果明顯更少，這對臨床研究和診斷具有重大意義。我們希望不久的將來，MT-PCR有更多的應用。為取得最佳PCR結果，選擇一個優秀的熱迴圈儀也是非常重要的。
參考文獻
- Ming-Yi W, Jian-Li G, Ying-Jian C, Yu S, Mei S, Hai-Zhu L, and Cheng-Kin H. Direct Detection of mecA, blaSHV, blaCTX-M, blaTEM, and blaOXA Genes from Positive Blood Culture Bottles by Multiple-touchdown PCR Assay.
- Henegariu O, Heerema N A, Dlouhy, S R, Vance, G H and Vogt, P H (1997) Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. Biotechniques 23, 504-511.