多重降落PCR (MT-PCR): PCR新应用成就更好的精确性和稳定性

MT-PCR是什么?

聚合酶链式反应，或称之为PCR，已使用近30年，在各种生化和医学实验室均有应用。然而，PCR最突出的问题是非靶DNA扩增，导致各种问题，尤其是假阳性结果。幸好多年来PCR技术在不断进步，发展出一种新型PCR技术——多重降落PCR（MT-PCR）。MT-PCR结合了多重PCR和降落PCR的特征。在一项PCR实验中，采用了多种引物检验多重DNA靶标。每个周期的退火温度从原设定温度降低0.5~1°C，直到达到最佳退火温度。

MT-PCR，出现在2016年*的一项新研究中（1），发展该技术旨在检测抗性基因。MT-PCR成功地识别出数个不同的靶细菌DNA，还阻止非靶DNA扩增反应，从而阻止假阳性结果。

MT-PCR如何解决多重PCR面临的问题？

常规PCR试验的目标是单个DNA模板，特定的引物会在20个反应周期内将模板扩增。在一个反应中采用多个引物和靶DNA，可节省大量时间，还能同时在一个PCR中扩增多个靶DNA*(2)。

但是，多重PCR有一个严重的缺点，很难在引物和DNA混合物中避免非靶DNA交叉扩增。因此，进行多重PCR前，我们必须提前选择特定的靶DNA。只选择不同DNA配对长度的靶DNA进行多重PCR。

虽然，多重PCR节省时间，但仍无法避免非靶DNA交叉扩增导致的错误。因此，我们需要MT-PCR。MT-PCR和多重PCR的主要差别在于退火温度。MT-PCR的退火温度随每个周期降低。设定的第一个周期（起始）退火温度比预期温度高 3~5°C 。一般而言，退火温度越高，引物和模板匹配越好。缓慢降低退火温度让PCR更有效。

精确而稳定地控制温度至关重要

本项MT-PCR研究的研究者在血液培养瓶和加标血液瓶中成功地识别了5个靶DNA，mecA, Blashv, Blactx-M, BlaTem和Blaoxa，参见图1。同时，没有交叉扩增和假阳性结果。（图2），试验中，在热循环仪上设定的起始退火温度为66℃，30秒。研究者将反应继续进行，但是每个周期退火温度降低0.5℃。温度控制的精确性和稳定性非常重要。BlueRay Biotech生产的TurboCycler热循环仪非常稳定，可精确而稳定地控制温度。该仪器的升降温速度快，可迅速设定需要的特定温度。还有一个样品模式，将样品和受试块的温差控制在最小绝对值。TurboCycler是研究者进行MT-PCR的理想选择。

图1  ：来自12个 加标血液培养瓶的样品的MT-PCR结果。第9~第13是靶基因的对照组。第1~第8明确显示靶基因在MT-PCR阵列中表达，且无其他交叉扩增。

图2  ：来自33个阳性血液培养瓶的样品在4h MT-PCR阵列的结果。明确显示靶基因，且无非靶基因表达。

在本项研究中，靶细菌DNA含有多重抗生素耐药性基因。被这些细菌感染的患者要及时接受正确的抗生素治疗，否则败血症会导致严重的后果。该项研究工作证明，MT-PCR可迅速鉴别有关细菌。

结论

MT-PCR不但可以迅速识别样品中多个靶细菌的基因，而且，还可以避免非靶DNA交叉扩增。与以往相比较，假阳性结果明显更少，这对临床研究和诊断具有重大意义。我们希望不久的将来，MT-PCR有更多的应用。为取得最佳PCR结果，选择一个优秀的热循环仪也是非常重要的。

参考文献:

Ming-Yi W, Jian-Li G, Ying-Jian C, Yu S, Mei S, Hai-Zhu L and Cheng-Kin H. Direct Detection of mecA, blaSHV, blaCTX-M, blaTEM, and blaOXA Genes from Positive Blood Culture Bottles by Multiple-touchdown PCR Assay.

Henegariu O, Heerema N A, Dlouhy, S R, Vance, G H and Vogt, P H (1997) Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. Biotechniques 23, 504-511.