在现代分子生物学研究中，核酸定量是不可或缺的步骤。准确的核酸定量对于确保实验结果的可靠性和可重复性至关重要。无论是进行 PCR、基因测序，还是其他分子生物学实验，了解样品中核酸的精确浓度都是成功的关键。
核酸定量的主要作用体现在优化实验条件、评估样品质量、确保下游应用的成功以及节省时间和资源。许多实验要求特定浓度的核酸输入，准确的定量有助于研究人员优化实验条件。通过定量，我们可以评估 DNA 提取和纯化的效率，并检测潜在的污染物。在 NGS（高通量测序）等应用中，准确的核酸定量对文库制备至关重要。此外，精准的定量可避免因核酸浓度不当而导致的实验失败，从而节省宝贵的时间和资源。
鉴于核酸定量的重要性，选择合适的定量方法尤为关键。不同方法各有优缺点，适用于不同的实验场景。
在进行核酸定量时，研究人员可以选择多种方法。每种方法基于不同的原理，适用于不同的实验需求。主要的核酸定量方法包括 UV-Vis光谱法（分光光度计法）、 荧光法、 实时定量PCR （qPCR）、凝胶电泳法和毛细管电泳法。这些方法各具特点，从简便快捷的UV-Vis法到高精度的 qPCR 法，为研究人员提供了多样化的选择。
UV-Vis光谱法是最常用的核酸定量方法之一，以其简便快捷而广受认可。该方法基于核酸在 260 nm 波长处具有最大吸收特性的原理。通过测量样品在该波长的吸光度，可计算核酸浓度。操作步骤包括使用缓冲液校准仪器、测量样品吸光度，并利用公式计算核酸浓度。
UV-Vis法的优势在于快速、操作简便，无需特殊试剂，并可同时评估样品纯度。然而，该方法也存在局限性，例如无法区分 DNA 和 RNA，对低浓度样品的检测灵敏度较低，且易受污染物影响。在常规的质粒 DNA 提取或基因组 DNA 提取后的浓度检测中，UV-Vis 法通常是首选方法。近年来，微量分光光度计的发展成为一大趋势，使得仅需1-2 μL样品即可完成测量，大幅提升了实验效率。
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荧光法是一种灵敏度高、特异性强的核酸定量方法，特别适用于低浓度样品的测定。该方法利用能特异性结合核酸的荧光染料，通过测量荧光强度来准确定量核酸。操作步骤包括制备标准曲线、将样品与荧光染料混合、测量荧光强度，并根据标准曲线计算核酸浓度。
荧光法的优势包括高灵敏度、高特异性，并且受污染物影响较小。然而，该方法需要特殊的荧光染料和仪器，成本相对较高，同时需要制备标准曲线。在 NGS 文库定量或 cfDNA 等低浓度样品的定量中，荧光法是首选方法。近年来，随着新型荧光染料的开发，检测的灵敏度和特异性进一步提升，使该方法在高精度核酸定量中的应用更加广泛。
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qPCR 是一种结合 PCR 扩增与荧光检测的高灵敏度、高特异性核酸定量方法。该方法通过实时监测 PCR 过程中产生的荧光信号强度来定量初始样品中的核酸含量。操作步骤包括设计特异性引物和探针、制备反应试剂、运行 qPCR 程序，并分析扩增曲线和 Ct 值。
qPCR具有极高的灵敏度和序列特异性，可同时进行定量和定性分析。然而，该方法需要专门的设备和试剂，成本较高，操作相对复杂，且实验耗时较长。在基因表达水平检测、病毒载量定量或极低浓度核酸样品的定量中，qPCR是首选方法。此外，在 FFPE 样本中降解 DNA，qPCR 是最可靠的定量方法。
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凝胶电泳法是一种可视化的核酸定量方法，特别适用于评估核酸的完整性和大小。该方法基于核酸在电场中的迁移速度与其分子量成反比的原理，并通过比较样品与已知浓度的核酸标准品的亮度进行半定量分析。
凝胶电泳法的优势在于可同时评估核酸的浓度、大小和完整性，直观可视化，且无需昂贵的专用设备。然而，该方法仅能进行半定量分析，检测灵敏度较低，且使用有毒染料可能存在安全隐患。在 PCR 产物检测、核酸完整性评估或粗略估算核酸浓度时，凝胶电泳法是一种非常实用的工具。
毛细管电泳法是一种自动化程度高、可同时分析核酸浓度和大小的技术。该方法结合了电泳分离与荧光检测技术，通过毛细管中的高分辨率分离来分析核酸。操作步骤包括样品制备与加载、自动进行毛细管电泳分离、荧光检测，以及数据分析和报告生成。
毛毛细管电泳法的优势在于高通量、自动化程度高，可同时提供核酸浓度和片段大小信息。然而，该方法设备昂贵，样品制备较为复杂，对操作人员的技术要求较高。在 NGS 文库质量控制、核酸片段分析或大规模样本筛查中，毛细管电泳法展现出独特优势。
选择合适的核酸定量方法对实验成功至关重要。主要考虑因素包括样品浓度范围、纯度、特异性要求、时间与成本、下游应用以及样品类型。高浓度样品（>10 ng/μL）通常可以使用UV-Vis法，而低浓度样品（<10 ng/μL）则适合荧光法或qPCR。在需要区分 DNA/RNA 或检测特定序列的情况下，荧光法或 qPCR 更为合适。例如，NGS 文库定量通常选择荧光法或 qPCR，而 FFPE 样本则以 qPCR 最为可靠。
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方法 |
灵敏度范围 |
主要优势 |
主要局限性 |
适用场景 |
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2-5 ng/μL |
快速、简单、无需特殊试剂 |
无法区分 DNA/RNA，易受污染物影响 |
中高浓度纯样品，快速检测 |
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0.1-0.5 ng/μL |
高灵敏度，可区分 DNA/RNA |
需要标准曲线，试剂成本较高 |
低浓度样品，需高精确度 |
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<0.1 ng/μL |
极高灵敏度，序列特异性 |
设备和试剂昂贵，耗时较长 |
极低浓度，特定序列检测 |
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凝胶电泳法 |
1-5 ng/band |
可视化 DNA 大小和完整性 |
半定量，灵敏度低 |
核酸完整性检查，PCR 产物验证 |
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毛细管电泳法 |
0.1-0.5 ng/μL |
高通量，自动化 |
设备昂贵，样品制备复杂 |
大规模样本分析，NGS 文库定量 |
值得注意的是，在日常实验室工作中，UV-Vis 光谱法和荧光法因其便捷性和广泛适用性，成为最常用的两种方法。UV-Vis法适用于快速检测中高浓度的纯 DNA 样品，而荧光法在处理低浓度或需要高精确度的样品时表现出色。
通常荧光法和qPCR的结果更可靠，特别是对于低浓度样品。UV-Vis 法可能因污染物的干扰而高估浓度。建议对重要样品采用多种方法进行交叉验证。
使用荧光法或 qPCR，这些方法对低浓度 DNA 更敏感。增加重复测量次数，并考虑使用载体 DNA（carrier DNA）以减少样品损失。确保使用低吸附的离心管和吸头。
qPCR或荧光法最适用于 NGS 文库定量。qPCR可以特异性检测带接头的文库分子，而荧光法则可提供准确的总 DNA 浓度。
对于 FFPE样本，qPCR是最可靠的方法。它可以特异性检测完整的核酸片段，避免降解核酸对测量结果的影响。
核酸定量是分子生物学研究中的关键步骤，每种定量方法都有其独特的优势和适用场景。选择合适的方法需要综合考虑多种因素。在日常实验室工作中，UV-Vis光谱法和荧光法仍然是最常用的技术。未来，核酸定量技术将继续发展，包括微流控技术、纳米技术、人工智能辅助等创新方向。研究人员应根据具体需求选择最适合的方法，同时关注新技术的发展，以不断提高实验的准确性和效率。